一、載體與質(zhì)粒的基本定義

1. 載體（Vector）

   指通過(guò)重組 DNA 技術(shù)，將有用的目的 DNA 片段送入受體細(xì)胞進(jìn)行繁殖和表達(dá)的工具，細(xì)菌質(zhì)粒是其中常用類(lèi)型。
2. 質(zhì)粒（Plasmid）的基本特征

• 結(jié)構(gòu)：染色體外的雙鏈、閉環(huán) DNA 分子，大小 1-200kb，以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞。

• 存在范圍：主要存在于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中。

• 功能：具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定拷貝數(shù)并表達(dá)遺傳信息。

• 宿主依賴(lài)：復(fù)制和轉(zhuǎn)錄需依賴(lài)宿主細(xì)胞的酶和蛋白質(zhì)，離開(kāi)宿主無(wú)法存活；但宿主無(wú)質(zhì)粒也可正常存活。

• 天然質(zhì)粒舉例：F 質(zhì)粒（F 因子 / 性質(zhì)粒）、R 質(zhì)粒（抗藥性因子）、Col 質(zhì)粒（產(chǎn)大腸桿菌素因子）。

二、質(zhì)粒的關(guān)鍵特性

1. 質(zhì)粒的復(fù)制類(lèi)型

2. 質(zhì)粒的不相容性（Incompatibility）

• 同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒：無(wú)法在同一宿主細(xì)胞共存，因復(fù)制和分配時(shí)競(jìng)爭(zhēng)，幾代后少數(shù)質(zhì)粒會(huì)丟失，僅存一種。

• 不同復(fù)制系統(tǒng)的質(zhì)粒：可在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定共存。

3. 質(zhì)粒的表型特征

• 對(duì)抗生素的抗性；

• 產(chǎn)生抗生素、大腸桿菌素、腸毒素；

• 降解復(fù)雜有機(jī)物；

• 編碼限制性?xún)?nèi)切酶與修飾酶。

三、質(zhì)粒載體的構(gòu)建與理想特性

1. 質(zhì)粒載體的構(gòu)建（基于天然質(zhì)粒改造）

• 保留核心功能：人工添加 1 個(gè)及以上選擇性標(biāo)記基因（如抗生素抗性基因）、含多個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的 多克隆位點(diǎn)序列。

• 簡(jiǎn)化結(jié)構(gòu)：去除大部分非必需序列，減小分子量，便于基因工程操作。

• 輔助序列：攜帶多用途序列，如肉眼鑒定重組克隆、產(chǎn)生單鏈 DNA（用于測(cè)序）、體外轉(zhuǎn)錄外源 DNA、鑒定片段插入方向、外源基因大量表達(dá)。

2. 理想克隆載體的特性

1. 分子量小、多拷貝、松弛控制型；

2. 具有多種常用限制性?xún)?nèi)切酶的單切點(diǎn)；

3. 能插入較大的外源 DNA 片段；

4. 具有易操作的檢測(cè)表型。

3. 常用質(zhì)粒載體

大小多為 1-10kb，如 pBR322、pUC 系列、pGEM 系列、pBluescript（pBS）。

四、細(xì)菌質(zhì)粒 DNA 的分離與存在形式

1. 分離的 3 個(gè)基本步驟

1. 培養(yǎng)細(xì)菌：使質(zhì)粒擴(kuò)增；

2. 裂解細(xì)胞：用溶菌酶破壞細(xì)胞壁，十二烷基磺酸鈉（SDS）或 Triton X-100 裂解細(xì)胞膜；

3. 分離純化：

• 染色體 DNA：纏繞于細(xì)胞碎片，因分子大易斷裂為線性片段，經(jīng)熱 / 酸 / 堿處理后變性，難以復(fù)性；

• 質(zhì)粒 DNA（共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA，cccDNA）：變性后可復(fù)性，以超螺旋形式溶于液相。

2. 質(zhì)粒 DNA 的 3 種存在形式

• 超螺旋 DNA：天然狀態(tài)，共價(jià)閉環(huán)，電泳泳動(dòng)速度最快；

• 開(kāi)環(huán) DNA（ocDNA）：一條鏈一處或多處斷裂，形成松弛環(huán)狀；

• 線狀 DNA（Linear DNA）：兩條鏈在同一處斷裂，電泳泳動(dòng)速度最慢。