在生物制藥領(lǐng)域，單克隆細(xì)胞系的構(gòu)建是藥物研發(fā)的關(guān)鍵步驟之一。SystImmune公司，一家專注于抗體研發(fā)的公司，面臨著快速構(gòu)建高產(chǎn)量表達(dá)雙特異性抗體的單克隆細(xì)胞系的挑戰(zhàn)。為了應(yīng)對這一挑戰(zhàn)， SystImmune采用了Cell Metric單克隆細(xì)胞追蹤成像儀，提高了細(xì)胞系開發(fā)的效率。 這里詳細(xì)介紹SystImmune公司如何利用 Cell Metric ™系統(tǒng)加速雙特異性抗體單克隆細(xì)胞系的構(gòu)建。

SystImmune的細(xì)胞系開發(fā)流程

SystImmune使用CHOZN® (Sigma) 作為表達(dá)平臺(tái)。CHOZN® GS-/- CHO細(xì)胞系是一種內(nèi)源性谷氨酰胺合成酶敲除細(xì)胞株，為必需氨基酸谷氨酰胺營養(yǎng)缺陷型，很容易據(jù)此來進(jìn)行篩選。

1.微池轉(zhuǎn)染和挑選

CHOZN細(xì)胞被轉(zhuǎn)染進(jìn)感興趣的基因，每孔鋪5000-10000細(xì)胞。由于采用了CHOZN系統(tǒng)，回收率很高，例如接種2-5板，回收率可達(dá)約80%。到第14天時(shí)孔中會(huì)有大量多克隆細(xì)胞。由于擴(kuò)增所有微池是很困難的，因此會(huì)進(jìn)行滴度測定來排除不表達(dá)的細(xì)胞微池。

2.微池的擴(kuò)增和篩選

產(chǎn)物表達(dá)最高的50個(gè)微池會(huì)選來擴(kuò)增（通過靜態(tài)培養(yǎng)和搖瓶），篩選并做滴度測定。靜態(tài)擴(kuò)增包括將微池細(xì)胞從96孔轉(zhuǎn)至24孔板，然后轉(zhuǎn)至T25和T75瓶中培養(yǎng)。搖瓶擴(kuò)增包括將微池中的細(xì)胞擴(kuò)增，后轉(zhuǎn)至30mL補(bǔ)料分批培養(yǎng)搖瓶中。SystImmune要對30mL補(bǔ)料分批培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行滴度測定，這樣做的原因是有時(shí)靜態(tài)擴(kuò)增的滴度數(shù)據(jù)同最終生物反應(yīng)器中滴度數(shù)據(jù)并不一致。

3.微池細(xì)胞有限稀釋

使用Cell Metric單克隆細(xì)胞追蹤成像儀進(jìn)行稀釋鋪板時(shí)，至少挑選3個(gè)微池，用40塊96孔板進(jìn)行有限稀釋操作。先用0.3-1個(gè)細(xì)胞/孔進(jìn)行鋪板，而后選擇了合適的的0.5個(gè)細(xì)胞/孔進(jìn)行鋪板。

4.克隆源性確證和存檔

Solentim Cell Metric imager用于對40塊細(xì)胞板進(jìn)行拍照，分別追蹤其在Day 0, Day 1 和Day 2的細(xì)胞分裂情況，并在Day 7拍照顯示其克隆形成情況。在此階段，SystImmune確認(rèn)了約200-300個(gè)克隆有著高滴度值，但通常選擇至少50個(gè)Cell Metric確認(rèn)的滴度最高的單細(xì)胞擴(kuò)增克隆。這種單細(xì)胞克隆的確認(rèn)是非常嚴(yán)格的，并需要生成相關(guān)報(bào)告用于提交IND。

5.克隆擴(kuò)增

先前步驟中選出的高表達(dá)克隆（基于圖像和滴度數(shù)據(jù)）用先前同樣的方法，從靜態(tài)培養(yǎng)到搖瓶培養(yǎng)進(jìn)行擴(kuò)增。另用一個(gè)30mL搖瓶補(bǔ)料分批培養(yǎng)，將高表達(dá)克隆繼續(xù)擴(kuò)增。

6.克隆評價(jià)

SystImmune基于細(xì)胞生長和滴度測試來最終確定哪些克隆被送到生產(chǎn)部門，并還需要將細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行純化交到分析部門，進(jìn)行蛋白質(zhì)量檢測——CE-SDS（毛細(xì)管電泳-SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳），HPLC-SEC（高效液相-尺寸排阻色譜），CIEF（等電毛細(xì)聚焦），結(jié)合和功能測試。他們同樣要檢測拷貝數(shù)，檢測支原體。

7.批量擴(kuò)增生產(chǎn)

后來SystImmune挑選了8個(gè)產(chǎn)量較高的克隆送去生產(chǎn)部門，進(jìn)行3L生物反應(yīng)器發(fā)酵，進(jìn)行活細(xì)胞密度（VCD）和IgG產(chǎn)量分析。

8.產(chǎn)生候選克隆

將好的候選克隆被挑選出來，創(chuàng)建研究細(xì)胞庫（RCB）。

細(xì)胞系開發(fā)過程中面臨的挑戰(zhàn)

同其他公司的CLD部門一樣，SystImmune公司在細(xì)胞系開發(fā)過程中也面臨著一些關(guān)鍵的問題：

l 細(xì)胞系開發(fā)過程中多步驟的復(fù)雜性

l 部門人手不夠

l 降低時(shí)間周期及成本

l 每個(gè)步驟中形成良好的規(guī)則

l 提交IND申請時(shí)可以形成規(guī)范的文件

l 可以證實(shí)細(xì)胞的克隆源性

對于后面兩點(diǎn)，同其他公司一樣，SystImmune公司已經(jīng)敏銳地覺察到FDA對于細(xì)胞系單克隆源性的要求，FDA的Sarah Kennett博士曾做過“Establishing Clonal Cell Lines – A Regulatory Perspective’ presentation"的報(bào)告。里面概述了ICH Q5D的條款"For recombinant products, the cell substrate is the transfected cell containing the desired sequences which has been cloned from a single cell progenitor"。

為細(xì)胞的克隆源性存檔

SystImmune選擇在細(xì)胞系的開發(fā)過程中使用Solentim的Cell Metric CLD來為細(xì)胞的克隆源性存檔。Cell Metric 單克隆細(xì)胞追蹤成像儀  可以對細(xì)胞孔進(jìn)行高銳利度的整孔成像，提供Day 0時(shí)的細(xì)胞狀態(tài)，從而為單克隆源性提供關(guān)鍵證據(jù)，因此只需要一輪克隆即可。

為了提供克隆源性的證據(jù)，SystImmune利用Cell Metric單克隆細(xì)胞追蹤成像儀的配套軟件的“輸出克隆報(bào)告"功能制作的報(bào)告文件。報(bào)告中展示了對所需要的細(xì)胞孔的整孔成像，接種細(xì)胞的具體位置，細(xì)胞如何隨時(shí)間逐漸分裂生長為一個(gè)克隆團(tuán)（此處僅顯示了Day0和Day1）。同樣地，孔內(nèi)同細(xì)胞形態(tài)相似的一些碎片和雜質(zhì)也會(huì)被拍到。這些碎片或雜質(zhì)是不會(huì)隨著時(shí)間而發(fā)生任何形態(tài)上的變化的，這也是證明該克隆團(tuán)為單克隆的重要基礎(chǔ)。

使用CHOZN平臺(tái)和以前的兩輪有限稀釋，SystImmune大概要用20周的時(shí)間獲得一個(gè)好的候選細(xì)胞系交給生產(chǎn)部門，這是一個(gè)非常耗時(shí)的過程，對于提交一個(gè)IND申請這是一個(gè)重要的限速步驟。

闡明細(xì)胞的單克隆源性在政策法規(guī)層面是非常重要的。SystImmune使用Cell Metric CLD能夠很好的捕獲細(xì)胞接種，數(shù)量增長直至形成克隆團(tuán)的圖像。

使用Cell Metric，SystImmune在細(xì)胞系建立過程中可以去掉一輪的有限稀釋，這意味著可以節(jié)省6-8周的時(shí)間仍能夠達(dá)到法規(guī)的要求。通過這種方式，SystImmune不僅加快了細(xì)胞系的開發(fā)速度，還確保了細(xì)胞系單克隆源性的合規(guī)性，這對于IND申請的提交至關(guān)重要。

SystImmune的這個(gè)案例充分展示了Cell Metric單克隆細(xì)胞追蹤成像儀在生物制藥研發(fā)中的巨大價(jià)值。通過提高細(xì)胞系開發(fā)的效率和確保單克隆源性，Cell Metric為生物制藥公司提供了加速藥物上市的關(guān)鍵工具。這不僅縮短了研發(fā)周期，還能在確保產(chǎn)品質(zhì)量和合規(guī)性的同時(shí)，降低研發(fā)成本。

蘇州阿爾法生物的STUDIUS生態(tài)系統(tǒng)，通過整合VIPS PRO單細(xì)胞鋪板、Cell Metric單克隆細(xì)胞追蹤成像儀以及ICON細(xì)胞成像系統(tǒng)，進(jìn)行 IgG產(chǎn)率評估，為細(xì)胞株構(gòu)建提供了一個(gè)高效的一體化解決方案。這個(gè)軟件平臺(tái)允許科學(xué)家根據(jù)特定參數(shù)自定義分析，并自動(dòng)、即時(shí)地處理數(shù)據(jù)，縮短了克隆排名和選擇所需的時(shí)間。這些 實(shí)驗(yàn)室儀器的使用不僅提高了細(xì)胞株構(gòu)建的效率和精確性，還幫助科學(xué)家加速了整個(gè)細(xì)胞開發(fā)過程。