熒光定量 PCR（qPCR）檢測低濃度樣本時(shí)，靈敏度受限于模板量少、擴(kuò)增效率低、背景信號(hào)干擾等問題。通過優(yōu)化樣本處理、反應(yīng)體系、擴(kuò)增策略及儀器參數(shù)，可提升檢測靈敏度。

以下從6 個(gè)核心維度詳細(xì)說明具體方法：

一、樣本制備：減少模板損失與抑制物干擾

低濃度樣本（如痕量核酸）的模板提取效率和純度是提升靈敏度的基礎(chǔ)，需重點(diǎn)優(yōu)化：

• 高效提取純化：選擇針對(duì)低濃度樣本的提取試劑盒（如磁珠法、柱提法），其通過特異性吸附核酸、減少洗脫體積（如從 50μL 降至 20μL），可將核酸回收率提升 30% 以上；避免使用酚 - 氯仿法（易殘留抑制劑）。

• 去除抑制物：樣本中若含多糖、蛋白、腐殖酸等抑制劑（常見于土壤、血液、糞便樣本），會(huì)顯著抑制 Taq 酶活性。可通過以下方法去除：

? 提取后加入BSA（1-2 μg/μL） 或甘油（5%-10%），競爭性結(jié)合抑制劑；

? 采用核酸純化柱二次純化，或用 DNase/RNase-free 水稀釋樣本（降低抑制劑濃度）。

• 模板濃縮：對(duì)體積較大的低濃度樣本（如腦脊液、尿液），可通過乙醇沉淀（加糖原作為載體）或真空濃縮儀濃縮，將模板濃度提升 5-10 倍（注意避免過度濃縮導(dǎo)致抑制劑富集）。

二、反應(yīng)體系優(yōu)化：提升擴(kuò)增效率與信號(hào)特異性

低濃度模板擴(kuò)增時(shí)，需通過優(yōu)化體系組分減少非特異性反應(yīng)，增強(qiáng)目標(biāo)信號(hào)：

• 引物與探針設(shè)計(jì)：

? 引物：長度 18-25 bp，GC 含量 40%-60%，避免二級(jí)結(jié)構(gòu)（ΔG > -6 kcal/mol）和引物二聚體（可通過 Primer-BLAST 或 Oligo 軟件驗(yàn)證）；擴(kuò)增片段長度控制在80-150 bp（短片段擴(kuò)增效率更高，尤其適合低模板量）。

? 探針：優(yōu)先選擇TaqMan 探針（比 SYBR Green 特異性更高，背景信號(hào)低），熒光基團(tuán)選用量子點(diǎn)或 Alexa Fluor 等強(qiáng)熒光分子，淬滅基團(tuán)用 BHQ（淬滅效率高于 TAMRA）；探針濃度優(yōu)化至 0.2-0.4 μM（過高易形成探針二聚體）。

• 酶與 dNTP 優(yōu)化：

? 選擇高保真、高擴(kuò)增效率的熱啟動(dòng)酶（如 Taq 酶的突變體，如 Platinum Taq），其在高溫下激活，可減少低溫時(shí)的非特異性擴(kuò)增；酶濃度可適當(dāng)提高（常規(guī) 1.25 U / 反應(yīng)→1.5-2 U / 反應(yīng)）。

? dNTP 濃度調(diào)整為0.2-0.3 mM（過高會(huì)抑制酶活性，過低則限制擴(kuò)增），并添加 dUTP（結(jié)合 UNG 酶可減少 PCR 產(chǎn)物污染）。

• 反應(yīng)體積縮減：將常規(guī) 20 μL 反應(yīng)體系縮減至 10 μL 或 5 μL，模板相對(duì)濃度提升 2-4 倍，同時(shí)減少試劑背景干擾（需使用低吸附 PCR 管，避免模板吸附損失）。

三、擴(kuò)增策略：增強(qiáng)低模板擴(kuò)增效率

針對(duì)低濃度模板的 “擴(kuò)增瓶頸"，可采用特異性更強(qiáng)的擴(kuò)增策略：

• 巢式 / 半巢式 qPCR：

? 第一輪用外側(cè)引物擴(kuò)增（20-25 循環(huán)），產(chǎn)物作為第二輪 qPCR 的模板（用內(nèi)側(cè)引物），通過兩輪擴(kuò)增富集目標(biāo)片段，靈敏度可提升 10-100 倍（需注意避免交叉污染）。

• 數(shù)字 PCR（dPCR）耦合：

若實(shí)驗(yàn)室有數(shù)字 PCR 儀，可將低濃度樣本通過 dPCR 進(jìn)行絕對(duì)定量。dPCR 通過將樣本分散至數(shù)萬微孔，實(shí)現(xiàn)單分子擴(kuò)增，避免傳統(tǒng) qPCR 的 “指數(shù)擴(kuò)增偏差"，對(duì) fg 級(jí)模板的檢測靈敏度比 qPCR 高 1-2 個(gè)數(shù)量級(jí)（尤其適合拷貝數(shù)變異檢測）。

四、儀器參數(shù)：增強(qiáng)信號(hào)檢測靈敏度

qPCR 儀的光學(xué)系統(tǒng)和溫控精度直接影響微弱信號(hào)的捕捉，需針對(duì)性調(diào)整：

• 光學(xué)模塊優(yōu)化：

? 選擇具有高靈敏度 PMT（光電倍增管） 或CCD 成像系統(tǒng)的儀器（如天能Tanon 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)），其可檢測低至 0.1 熒光單位的信號(hào)變化。

? 調(diào)整熒光檢測增益值（Gain）：在儀器軟件中提高目標(biāo)熒光通道的增益（如 FAM 通道），增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度（需同時(shí)檢測空白對(duì)照，避免增益過高導(dǎo)致背景噪音增加）。

• 循環(huán)參數(shù)調(diào)整：

? 延長退火 / 延伸時(shí)間：低濃度模板結(jié)合引物的概率低，可將退火時(shí)間從 30 秒延長至 45-60 秒，延伸時(shí)間從 30 秒延長至 60 秒（適用于長片段，但需避免酶活性衰減）。

? 增加循環(huán)數(shù)：常規(guī) qPCR 循環(huán)數(shù)為 40，低濃度樣本可增加至 45-50 循環(huán)（需設(shè)置陰性對(duì)照，排除非特異性擴(kuò)增累積）。

五、減少污染與背景信號(hào)

低濃度樣本擴(kuò)增時(shí)，微量污染（如氣溶膠、交叉污染）或非特異性擴(kuò)增的影響被放大，需嚴(yán)格控制：

• 實(shí)驗(yàn)環(huán)境分區(qū)：將樣本制備區(qū)、反應(yīng)體系配置區(qū)、擴(kuò)增區(qū)分離，使用獨(dú)立移液器和耗材（如帶濾芯吸頭）。

• 抑制非特異性擴(kuò)增：

? 反應(yīng)體系中加入UDG 酶（尿嘧啶 - DNA 糖基化酶） 和 dUTP，擴(kuò)增前 37℃處理 10 分鐘，降解含 dUTP 的污染產(chǎn)物。

? 優(yōu)化退火溫度：通過梯度 PCR 確定最高特異性退火溫度（通常比 Tm 低 3-5℃），減少引物二聚體和非特異性條帶。

六、數(shù)據(jù)處理：降低隨機(jī)誤差

低濃度樣本的擴(kuò)增曲線波動(dòng)較大，需通過數(shù)據(jù)處理提高可靠性：

• 增加技術(shù)重復(fù)：每個(gè)樣本設(shè)置 3-5 次技術(shù)重復(fù)，通過平均值減少隨機(jī)誤差（避免單一重復(fù)的假陰性）。

• 優(yōu)化閾值（Ct 值）設(shè)定：手動(dòng)調(diào)整閾值至擴(kuò)增曲線的指數(shù)期早期（避免進(jìn)入平臺(tái)期），確保低濃度樣本的 Ct 值被準(zhǔn)確捕捉（而非被背景信號(hào)掩蓋）。

總結(jié)

提升低濃度樣本 qPCR 靈敏度的核心邏輯是：模板保留→增強(qiáng)擴(kuò)增特異性→優(yōu)化信號(hào)檢測→控制背景干擾。實(shí)際操作中，可優(yōu)先從樣本提取（如磁珠法 + 濃縮）和反應(yīng)體系（如熱啟動(dòng)酶 + 巢式 PCR）入手，結(jié)合儀器參數(shù)調(diào)整，通常可將檢測下限從 ng 級(jí)提升至 pg 甚至 fg 級(jí)，滿足痕量核酸檢測需求（如病毒早期感染、微量腫瘤 DNA 檢測等場景）。